原標題：Peptide SMIM30 promotes HCC development by inducing SRC/YES1 membrane anchoring and MAPK pathway activation.
期刊：Journal Of Hepatology
影響因子：18.946
關鍵詞：lncRNA翻譯，LINC00998，SMIM30，SRC，YES1，肝細胞癌
主要技術方法：質譜檢測（LC-MS/MS），RNA免疫共沉淀（RIP-Seq），染色免疫共沉淀（ChIP-qPCR），雙熒光素酶報告基因，免疫共沉淀（CoIP-MS），RNA-seq等。

除了典型的蛋白質編碼基因之外，很多非編碼RNA（例如lncRNA）能夠影響細胞過程，在各種人類癌癥中也經常觀察到lncRNA的水平失調。雖然lncRNA最早被認為是一種非編碼RNA，但近年來越來越多的證據表明，一些lncRNA含有小的開放閱讀框(SmORF)，并且其編碼的小肽具有生物學功能。

2020年5月，上海第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院的研究人員發(fā)現肝癌細胞中高表達的LINC00998編碼一種內源性小肽“SMIM30”，該小肽（非RNA）可以通過調節(jié)細胞增殖和遷移促進肝細胞癌（HCC）腫瘤發(fā)生，其水平與HCC患者的不良生存率相關。SMIM30由c-Myc轉錄，然后驅動非受體酪氨酸激酶SRC/YES1的膜錨定，進而激活下游MAPK信號通路，促進肝癌的發(fā)生發(fā)展。該研究不僅揭示了ncRNA編碼的多肽促進肝癌發(fā)生的新機制，而且提示這些多肽可以作為肝癌治療的新靶點和肝癌診斷和預后的新生物標志物。

1.    發(fā)現肝癌細胞中高表達的LINC00998編碼內源性小肽“SMIM30”
使用核糖體蛋白S6(RPS6)抗體對4種癌細胞進行RNA免疫共沉淀和高通量測序(RIP-Seq)，發(fā)現4種癌細胞中同時富集到的lncRNA共105個。通過潛在編碼框(SmORF)分析、CPC編碼潛能預測、GEPIA數據庫分析和新鮮冷凍組織的PCR，發(fā)現具有編碼潛能的LINC00998在HCC和癌旁組織中差異表達。RIP-qPCR再次確認了LINC00998可以結合RPS6，說明LINC00998可能定位于活躍翻譯的核糖體，潛在編碼一種功能肽。數據庫查找發(fā)現，LINC00998的潛在編碼肽收錄在uniprot中，命名為“SMIM30”，但缺乏多肽表達的證據及功能信息。PCR結果顯示LINC00998末端具有polyA結構。外源載體構建和細胞表達檢測，以及內源SMIM30抗體調取和LC-MS/MS分析，都確認了SMIM30肽的表達。免疫熒光和WB實驗表明SMIM30蛋白定位于細胞膜上，可能是一種保守的疏水膜肽。

2.    SMIM30肽通過調節(jié)細胞增殖和遷移促進HCC進程
接下來，通過shRNA慢病毒抑制了HCC細胞中LINC00998和SMIM30的水平。CCK8、transwell、流式周期檢測等細胞實驗表明，LINC00998/SMIM30下調干擾了細胞周期，抑制了細胞的增殖和遷移。為了確定這一效應是由LINC00998的RNA水平改變導致，還是由于編碼多肽的減少導致，作者構建了起始密碼子突變而不能表達SMIM30的載體。功能回補實驗顯示，smORF突變的載體不能彌補LINC00998干擾的效應，說明LINC00998的編碼肽SMIM30，而不是其lncRNA，促進了HCC細胞的惡性行為。體內實驗顯示，SMIM30敲除組的小鼠腫瘤更小，肺轉移也更少。這些結果表明LINC00998編碼的SMIM30肽通過正向調節(jié)細胞增殖和遷移促進HCC發(fā)展。

3.    SMIM30肽與受體酪氨酸激酶SRC/YES1相互作用
為了確定SMIM30肽的作用機制，在表達flag- SMIM30的細胞中用flag抗體做CoIP-MS，篩選到了與SMIM30相互作用的蛋白質——非受體酪氨酸激酶SRC/YES1。LINC00998敲除并沒有改變SRC和YES1的蛋白水平，但使其磷酸化水平發(fā)生了變化，SMIM30的轉染又逆轉了這一變化，說明SRC/YES1的激活狀態(tài)與SMIM30的表達水平有關。另外，它們之間的相互作用不受RNase處理的影響，表明這種互作不依賴于RNA。內源性的Co-IP實驗確認了它們之間的結合，免疫熒光也顯示SRC/YES1和SMIM30肽在細胞質外緣共定位。之后，作者構建了一系列的SRC/YES1結構域突變載體，最終確定SRC/YES1的N端膜結合結構域對它們與SMIM30肽之間的互作是必需的。

4.    SMIM30肽激活MAPK信號通路并受到c-myc調控
接下來，研究者對SMIM30沉默的HCC細胞進行了轉錄組測序（RNA-seq），GO分析表明，一些差異基因富集在膜靶向蛋白和膜錨定蛋白條目中。KEGG pathway分析表明一些差異基因富集在MAPK信號通路中。通過SMIM30敲除實驗，發(fā)現MAPK通路下游一些基因的磷酸化水平發(fā)生了變化，SMIM30-ORF的加入會逆轉這種變化。作用采用Co-IP方法進一步確定了SMIM30、SRC/YES1和MAPK通路之間的關系，SMIM30起銜接SRC/YES1和integrin β1的作用（integrin β1介導MAPK通路），當SMIM30低表達時，SRC/YES1和integrin β1之間的結合減弱。此外，作者利用JASPAR工具預測了可能結合SMIM30啟動子的轉錄因子——c-myc。ChIP實驗表明c-Myc可以和預測的啟動子位點結合，雙熒光素酶報告基因證實c-Myc能增強SMIM30的轉錄。