多組氨酸標記蛋白占常規(guī)重組蛋白表達和純化的 90% 以上。組氨酸標簽與其他親和標簽相比具有許多優(yōu)點，例如小尺寸、與 IMAC 樹脂結合的高親和力（固定金屬親和層析），并允許對重組蛋白進行一步純化。 但有時組氨酸標記的蛋白質不會與親和柱結合并逃避它的捕獲和隨后的純化。 雖然這種情況并不常見，但無論何時發(fā)生都會令人非常沮喪。 但是，如果出現(xiàn)此類問題，有一些方法可以進行故障排除，輝駿生物下面將逐步討論解決方案。 

您的增溶緩沖液是否需要優(yōu)化？  

Ni-NTA 樹脂對還原劑（如 DTT）和螯合劑（如 EDTA 或 EGTA）的存在很敏感，請確保增溶緩沖液中不含任何這些物質，因為它們會影響 IMAC 樹脂的結合能力。  

通常，蛋白質溶解/結合緩沖液中的咪唑濃度保持在 15-25 mM 以防止非特異性蛋白質與 IMAC 樹脂結合，建議檢查溶解緩沖液中的咪唑濃度，有時即使低咪唑濃度也可以防止結合將蛋白質轉移到 Ni-NTA 樹脂上 。 在這種情況下，應仔細嘗試較低的濃度，以免干擾蛋白質與親和樹脂的結合。 另一個關鍵因素是增溶緩沖液的 pH 值。 當增溶緩沖液的 pH 值較低時，會導致組氨酸側鏈質子化，這會阻止組氨酸殘基與成功結合所需的金屬配位。 通常建議保持緩沖液的 pH 值接近蛋白質的等電點。 添加咪唑會降低 pH 值，因此建議在添加咪唑后調節(jié)結合/增溶緩沖液的 pH 值。 

您的親和樹脂新鮮有效嗎？  

為確保親和樹脂正常工作，請在同一緩沖液中對帶有 His 標簽的對照蛋白（之前已使用 IMAC 純化過的蛋白）與感興趣的蛋白質進行批量結合。 如果對照蛋白質與咪唑結合并洗脫，但您的目標蛋白質繼續(xù)出現(xiàn)在流通和柱洗滌中并且沒有洗脫，則是時候認真起來尋找其他原因了。

首次嘗試純化新型蛋白質時，請始終使用新鮮的 Ni-NTA。  

您的蛋白質是否隱藏了組氨酸標簽？  

某些蛋白質可以在折疊的天然結構中隱藏多組氨酸標簽，從而阻止蛋白質與 IMAC 親和柱的結合。 結果是 標簽無法與金屬（通常是鎳或鈷）協(xié)調。 標簽的不可接近性可能是由于標簽被隱藏在折疊蛋白質的三維構象中。 一種快速而可靠的方法是在溶解緩沖液中存在強變性劑（如尿素或氯化胍）的情況下進行純化。 尿素和氯化胍都是強大的變性劑，會使蛋白質展開，如果蛋白質在這些變性劑存在的情況下與樹脂結合，則可以肯定地說折疊的蛋白質隱藏了他的標簽并阻止了它與 IMAC 樹脂的結合。                

如何克服它？  

克服隱藏組氨酸標簽問題的方法有很多，其中一些方法如下：

1、在變性條件下純化蛋白質，稍后再折疊。  

2、添加接頭序列以將蛋白質與聚組氨酸標簽與蛋白質分開，通常可以使用聚絲氨酸或聚甘氨酸的接頭。 該策略要求在克隆步驟進行干預。靈活接頭的存在確保多組氨酸標簽仍可用于與 IMAC 樹脂結合，并且不會被蛋白質隱藏。  

3、最后的選擇是將 poly-His 標簽放在相反的末端，看看這樣的交換是否允許 His 標簽綁定到親和矩陣。  

通常這些策略之一會起作用，但如果它們仍然不起作用，那么可以使用更大的親和標簽，例如 GST 或 MBP，而不是小的組氨酸標簽。