純化的 RNA 樣本是當今許多廣泛使用的檢測的重要起點，從 RT-qPCR 到下一代測序。  雖然從細胞樣本中提取和純化 RNA 的主要方法只有三種，但在分離 RNA 時，有無數注意事項可以幫助您優(yōu)化工作流程。  輝駿生物在本文列舉了一些純化高質量 RNA 的方法技巧，以提高您對后續(xù)檢測結果的信心。

RNA提取純化的主要方法

雖然提取方法的選擇有時取決于樣品類型，但通常這三種方法可用于大多數樣品。  即使是更難裂解和提取 RNA 的細胞類型，如細菌、植物和酵母，也可以使用額外的裂解步驟成功提取。

1.苯酚/氯仿法

這是最古老、久經考驗的提取 RNA 的方法。   它使用簡單但費力的方案，該方案依賴于分子種類在有機溶劑和水中的不同溶解度。  苯酚/氯仿方法可以容納更大的樣品，但它的整體性較低且不易自動化。孵育時間和沉淀溫度很重要，他使用低溫來保護 RNA 免受 RNA 酶的降解。 應注意不要干擾過程中形成的相[以防止 DNA 或蛋白質污染 RNA，因此需要良好的處理能力，苯酚/氯仿方法通常會產生更清潔的 RNA，并允許從較少量的細胞中提取 RNA與下面的離心柱方法相比。

2.自旋柱/柱色譜法

離心柱方法使用包含硅膠過濾柱的小型離心管。  用 RNase 抑制劑和高鹽濃度處理的裂解樣品在離心過程中通過離心柱，而 RNA 仍然與柱內的二氧化硅結合。  洗滌去除雜質，然后用水從硅膠過濾器中洗脫純化的 RNA。

離心柱以方便的試劑盒形式廣泛使用，通常使用簡單、快速的方案。  但這可能會因樣品裂解或均質化不完全或過濾器過載而變得復雜。使用適量的輸入材料很重要，因為使用過多的樣品可能會降低裂解效率，引入過量的 RNA 以外的細胞成分，并損害 RNA 與 RNA 純化柱的結合。自動化是可能的，但不如自動化磁珠方法方便。

離心柱法僅適用于小樣本，但可以使用各種樹脂通過柱層析純化大量的 RNA（例如克到千克）。  純化工作流程中最重要的一步是優(yōu)化上樣和洗脫步驟以獲得最佳容量和產量，同時保持高純度。

通過柱層析純化 mRNA 時，優(yōu)化鹽濃度尤為重要。在較高的鹽濃度下，mRNA 可以沉淀或形成更高級的結構，如 dsRNA。在為 oligo(dT) 親和力柱制定加載方案時，首先確定 mRNA 沉淀或形成雙鏈的鹽濃度是有幫助的，因為低于此濃度的加載有助于恢復和純度。與 oligo(dT) 結合所需的鹽含量與需要中和的核苷酸數量有關。

3.磁珠法

該方法使用涂有二氧化硅或其他結合 RNA 的配體（例如 oligo(dT)）的磁珠來分離具有完整 polyA 尾巴的 mRNA 分子。將珠子與細胞裂解物和 RNase 抑制劑一起孵育，然后使用磁場將其固定到位，同時去除上清液（含有不需要的碎片和雜質），并洗滌珠子以去除殘留的雜質。 將珠子重新懸浮在水中會洗脫純化的 RNA。

這是一個快速、簡單的協(xié)議，易于自動化進行高通量工作。  沒有過濾器柱消除了對過濾器堵塞或過載的擔憂。  更粘稠的樣品可能會帶來挑戰(zhàn)，因為在孵育過程中珠子和 RNA 可能更難以接觸。